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G. Ferreira de A.*, F. Pedraza O.**, J.F. Robledo C.*, B. Vieco***, M. Restrepo*** *Escuela
de Medicina Veterinaria. Facultad de Ciencias Agrarias. **Departamento
de Salud Animal. Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia. ***
Instituto de Patología Hospital Universitario San Vicente de Paul
(HUSVP). |
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1.
INTRODUCCIÓN
Las neoplasias mamarias en caninos a escala mundial tiene alta incidencia, con una frecuencia de presentación que oscila entre 25% y el 50% de todas las neoplasias en esta especie. Dichas neoplasias se presentan usualmente hacia los seis años de edad pero pueden ocurrir incluso en caninos menores de dos años; además, en forma incidental los machos pueden afectarse (7, 8, 10, 15, 16). La literatura medica informa una mayor frecuencia del tumor mixto mamario canino en contraste con el adenocarcinoma y carcinoma mamario (2, 10, 19, 20). En la ciudad de Medellín (Colombia), las neoplasias mamarias en perros domésticos ocupan el segundo lugar en frecuencia de presentación (14%) después de las de piel (40%) (3). Respecto a la glándula mamaria, el 65% de las neoplasias corresponde a tumores malignos y 35% a los benignos. La presentación y análisis de las neoplasias mamarias en las hembras caninas revelaron una mayor frecuencia para el carcinoma (55,7%), seguido por el tumor mixto (36,1%) y otras neoplasias (8,2%) (3). Histogenéticamente los tumores mamarios pueden originarse de las células que revisten los conductos y acinos, de las células mioepiteliales o de células del tejido conectivo subyacente (19). En el caso del tumor mixto mamario canino los componentes histológicos se caracterizan por la presencia de células fusiformes y mioepiteliales, acompañadas de tejido conectivo adiposo, óseo o cartilaginoso; estos últimos componentes son determinantes en el diagnóstico de este tipo de neoplasias (19, 20). Tanto en el ser humano como en los caninos, las células mioepiteliales del tejido mamario pueden detectarse inmunohistoquímicamente con anticuerpos monoclonales dirigidos contra tipos específicos de filamentos intermedios de humanos y animales (1, 4, 5, 6, 9, 19, 20). La técnica de inmunohistoquímica se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales marcados con enzimas y una sustancia cromógena que permite visualizar la reacción. Entre las enzimas más utilizadas como marcadores se encuentra la peroxidasa, que puede ser directa (cuando la enzima conjuga con el anticuerpo primario) o indirecta (cuando la enzima se conjuga con el anticuerpo secundario). La técnica más utilizada actualmente es la peroxidasa-antiperoxidasa, aunque también es de gran uso la estreptavidina (avidina-biotina) y el complejo avidina-biotina-peroxidasa (5, 6, 12, 17). Dentro de las ventajas de utilizar la técnica de inmunohistoquímica están: su alta sensibilidad, especificidad y versatilidad; además, el especimen coloreado puede ser examinado con un microscopio de luz común. En el presente estudio se utilizó un marcador para células epiteliales (queratina), uno para células mesenquimatosas (vimentina), uno para células musculares (desmina) y uno para células mioepiteliales (actina a músculo liso) (4, 5, 6, 13, 19, 20, 22). Las citoqueratinas son proteínas que constituyen filamentos intermedios intracelulares, presentes casi exclusivamente en las células epiteliales (19, 20). Estas proteínas hacen parte del citoesqueleto de estas células y constituyen un grupo heterogéneo de diferente peso molecular y punto isoeléctrico (12, 21). Las citoqueratinas de elevado peso molecular se expresan en la mayoría de los epitelios estratificados y en los carcinomas escamosos; las de bajo peso molecular, por el contrario, son especificas de los epitelios simples y de los adenocarcinomas. Los diversos epitelios del hombre poseen entre dos y diez de estos tipos de queratinas que los caracterizan y al utilizar anticuerpos contra ellas, pueden dar reacción cruzada en los tejidos animales (4, 5, 12, 19, 20, 21). La vimentina se encuentra en diferentes tipos celulares en su estado embrionario para ser reemplazados por los filamentos intermedios específicos en el proceso de diferenciación de las células mesenquimales a fibroblastos, células subendoteliales, condrocitos, histiocitos, y algunas células musculares lisas constituyentes de paredes vasculares. Su validez como marcador tumoral ha sido comprobada en distintas series de tumores animales como el fibrosarcoma canino, osteosarcoma canino, rabdomiosarcoma canino y felino, leiomiosarcoma canino, hemangiosarcoma, hemangiopericitoma canino, melanocitoma maligno canino e histiocitoma canino (6, 14, 18). La desmina es una proteína que forma el citoesqueleto de las células musculares lisas, esqueléticas y cardíacas, proporcionando una red citoesquelética para la inserción e integración mecánica de las proteínas contráctiles. Su papel en la identificación de los rabdomiosarcomas es muy importante porque este tipo de tumores no siempre presenta las estriaciones típicas que sirven para diferenciarlos y pueden confundirse con otros tumores como carcinomas y linfomas sobre todo cuando presentan formas celulares pequeñas poco diferenciadas. Su utilidad ha sido ensayada en muy escaso número de tumores caninos (6, 11, 14, 22). La actina a músculo liso está presente en todos los tipos de células. Las principales actinas se clasifican como alfa, beta y gamma que respectivamente están presentes en las células musculares, no musculares y en ambas. La expresión de las actinas en las células estriadas y lisas es diferente, por eso los anticuerpos creados frente a ellas sirven tanto para diagnosticar tumores de tipo muscular como para especificar si lo conforman fibras estriadas o lisas (6, 18, 19, 20).
Tejidos Se recolectaron doce especímenes de tejido mamario neoplásico canino remitidos al Laboratorio de Patología Animal de la Universidad de Antioquia (Medellín, Colombia) entre los años 1985 y 1996. Mediante el uso de una coloración de rutina y de acuerdo con el patrón histológico observado, todos los especímenes que se conservaban en sus respectivos bloques de parafina correspondieron a tumor mixto mamario maligno; no fue posible para este estudio, el análisis del tumor mixto mamario benigno. Los tejidos evaluados procedieron de caninos de diferentes razas, en su totalidad de hembras con edades que oscilaron entre los 4 y 15 años; el tiempo de evolución de estas neoplasias varió entre 15 días y 14 meses con un promedio de 4,5 meses. Por otro lado, se obtuvieron once muestras mediante biopsias (fragmentos pequeños de tejido mamario de aproximadamente 3 cc de volumen) y una, mediante operación quirúrgica debido al gran tamaño de la neoplasia que pesó aproximadamente 1.030 gramos. No se obtuvieron muestras a partir de necropsias. En ninguna de las neoplasias se encontró antecedente de metástasis ni recidiva.
Todos los anticuerpos usados correspondieron a anticuerpos monoclonales de ratón (Tabla I).
Los tejidos diagnosticados (entre 1985 y 1996) como tumor mixto mamario maligno por coloración de rutina (Hematoxilina-Eosina) fueron previamente procesados para obtener cortes de tejido en láminas de vidrio porta objetos después de su fijación en formalina amortiguada al 10% (no más de 24 horas) y su inclusión en parafina (a temperatura máxima de 601 C). Los tejidos se procesaron en el Laboratorio de Inmunohistoquímica del Instituto de Patología del Hospital Universitario San Vicente de Paul (HUSVP). Con el uso del micrótomo se realizaron de cada caso secciones de tejidos de 4 micrómetros y para cada uno de los cuatro filamentos intermedios se obtuvo un control negativo y la respectiva lámina problema. Los tejidos se colocaron sobre láminas de vidrio portaobjetos cargadas eléctricamente*. Para quitar la parafina de los cortes se colocaron en una estufa a 60 1C durante una noche, posteriormente, los tejidos fueron tratados con xilol fresco (tres baños de diez minutos cada uno) y luego tratados mediante dos baños de tres minutos con alcohol isopropílico absoluto, un baño de tres minutos con alcohol isopropílico al 90% y un baño de tres minutos con alcohol isopropílico al 70%. Al final de la hidratación se lavaron las placas con agua corriente. Las secciones sin parafina fueron incubadas en peróxido de hidrógeno al 6% por diez minutos para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena y posteriormente se lavaron con agua corriente. La recuperación antigénica para vimentina y desmina se realizó mediante pretratamiento con citrato amortiguado (pH=6) en horno microondas a máxima potencia durante quince minutos y luego se dejó enfriar por treinta minutos. Para el cóctel de queratinas se realizó digestión enzimática con tripsina porcina tipo 2** durante quince minutos, la digestión se detuvo con agua corriente. La actina a músculo liso usualmente no necesita recuperación antigénica. De acuerdo con las recomendaciones, se hicieron lavados con agua desionizada y además solución amortiguada de fosfato (PBS) por cinco minutos. Los tejidos se cubrieron con suero normal de equino (diluido 1:5 en PBS) y se colocaron en cámara húmeda a temperatura ambiente durante veinte minutos previo a la incubación con el anticuerpo primario. Antes de lavar, se eliminó el exceso de suero y se aplicó anticuerpo primario (Tabla I) a su dilución óptima (vimentina 1:100, desmina 1:100, actina músculo liso 1:50, citoqueratinas 1:100), durante una hora en cámara húmeda a 311C. Luego el anticuerpo secundario biotinilado*** se incubó durante treinta minutos en cámara húmeda y a temperatura ambiente. Posteriormente el complejo avidina-biotina-peroxidasa*** se incubó de la misma forma. Entre cada paso se realizó el lavado con PBS por diez minutos. Se aplicó el cromógeno 3-3 diaminobenzidina**** hasta obtener la tonalidad café deseada, después de lavar con agua desionizada y agua corriente. La coloración de las láminas fue contrastada con Hematoxilina de Harris por tres minutos, lavando con agua corriente y agua amoniacal, hasta obtener una coloración azul. Adicionalmente, se deshidrataron los tejidos mediante cambios de alcohol isopropílico al 70% y 95%, luego dos cambios en alcohol absoluto. Finalmente, se realizaron dos cambios en xilol y se usó bálsamo de Canadá para sellar las láminas de vidrio con el tejido, antes de rotularlas.
El control negativo utilizado se obtuvo omitiendo el antisuero primario en el proceso, mientras que el control positivo se obtuvo de tejidos mamarios neoplásicos humanos suministrados por el Laboratorio de Inmunohistoquímica del Instituto de Patología del Hospital Universitario de San Vicente de Paul (HUSVP).
En el análisis histopatológico mediante coloración de rutina (Hematoxilina y Eosina), la mayoría de los especímenes tumorales mostraron áreas de cartílago inmaduro y tejido óseo calcificado (osteoblastos); además de la proliferación de las células de conductos y acinos, la presencia de células pleomórficas y núcleos hipercromáticos prominentes confirmaron el carácter de malignidad de los tejidos analizados. Respecto a la coloración inmunohistoquímica, la citoqueratina (Fig. 1) reaccionó positivamente de un color marrón intenso para todos los epitelios acinares y de conductos, los núcleos permanecieron azulados, con prominentes nucleolos. El tejido conectivo estromal permaneció de un color azul claro. Para la vimentina (Fig. 2), resaltó la coloración marrón de muchas células mioepiteliales, como también de los fibroblastos del tejido conectivo estromal. En todos los casos las células de cartílago inmaduro y grupos condroides conservaron un patrón de tinción positivo.
En algunos de los casos los osteoblastos no respondieron a la marcación pero mostraron buena especificidad en el resto. Igualmente, las membranas basales y el material proteinaceo (fibrinoide) en la luz de los acinos y conductos, reaccionaron positivamente en algunos de los tejidos analizados. Los epitelios de acinos y conductos no se marcaron, conservando un color azul claro. La actina a músculo liso (Fig. 3) reaccionó positivamente en las células mioepiteliales, que se marcaron de un color marrón intenso, lo cual permitió ver su distribución en contraste con los fibrocitos y los fibroblastos que no se marcaron. El músculo liso de la pared de arteriolas también presentó una marcación positiva y el cartílago fue negativo para este marcador. Algunas membranas basales de acinos y conductos parecieron marcarse positivamente, situación que parece obedecer más bien a la localización de las células mioepiteliales imperceptibles sobre dichas membranas. Los epitelios de acinos y conductos, al igual que con el antisuero vimentina permanecieron de un color azul claro. La desmina (Fig. 4) mostró poca marcación para los tejidos analizados y apenas en una minoría marcó de color marrón algunas células mioepiteliales, la pared muscular de las arteriolas y sólo en un caso marcó un segmento de músculo esquelético invadido por el tumor.
Los resultados de la aplicación de la técnica de inmunohistoquímica para determinar la distribución de los filamentos intermedios en el tumor mixto mamario canino, se observan en la Tabla II.
Los doce casos estudiados correspondieron en su orden de frecuencia a las razas, Pastor alemán (2 casos), Criollo (2 casos), Cocker (2 casos), Springer spaniel (1 caso), Ovejero inglés (1 caso), Doberman (1 caso), Basset hound (1 caso), Pinscher (1 caso) y Pequinés (1 caso), lo cual concuerda con los resultados sobre neoplasias de la glándula mamaria registrados en Medellín Colombia, entre 1968 y 1994 (3). Debido a la alta susceptibilidad familiar de las hembras caninas a sufrir neoplasias mamarias (10) y teniendo en cuenta la alta prevalencia de estas neoplasias en la ciudad de Medellín (3) se consideró importante la utilización de técnicas específicas, confiables, rápidas y de actualidad para el diagnóstico de estas neoplasias y de otros diagnósticos en general. Al implementar la técnica de inmunohistoquímica en el Laboratorio de Patología Animal de la Universidad de Antioquia, con marcadores tales como citoqueratinas, desmina, vimentina y actina a músculo liso, se pudo determinar su comportamiento en los tejidos epitelial y mesenquimatoso de las neoplasias mamarias estudiadas. Con el uso de esta técnica se da el primer paso en la ciudad de Medellín, sobre el uso de la utilización de procedimientos diagnósticos de actualidad mundial y que apenas comienzan a incursionar en el campo veterinario en Colombia. Al realizar la recopilación de los diagnósticos de tumores mixtos mamarios caninos para un periodo de diez años, se encontró que los diagnósticos correspondieron en su totalidad a tumor mixto mamario canino, que es una de las neoplasias mas frecuentes en este medio; sin embargo, la dificultad en la consecución de casos en otros laboratorios de referencia nacional probablemente se debió a que este tipo de patologías se resuelve mediante cirugía realizada por el veterinario clínico sin remitir los especímenes al laboratorio. Respecto a los marcadores utilizados, actina a músculo liso, citoqueratina y vimentina, todos ellos se consideran de gran utilidad práctica en el diagnóstico del tumor canino mixto mamario maligno destacándose por su gran especificidad los dos primeros. La vimentina por su parte, posee una amplia variedad de marcación en células y elementos de tejido conectivo, sin que pueda considerarse una característica constante (ver resultados). Se destaca la buena marcación de fibroblastos, fibrocitos, células de cartílago inmaduro, grupos controides, células fusiformes, osteoblastos y células estrelladas (de núcleos redondeados y nucleolos visibles) que constituyen el paso intermedio en su diferenciación hacia los componentes conectivos del tumor mixto mamario. La desmina mostró una pobre especificidad respecto a los otros marcadores. Por lo anterior se concluye que la utilización de este marcador tumoral es de poca ayuda en el diagnóstico inmunohistoquímico de tumores mixtos mamarios malignos. En síntesis, se puede concluir que de los cuatro marcadores utilizados, tres resultaron muy útiles como ayuda diagnóstica en el tumor mixto mamario maligno. Esto es importante si se tiene en cuenta que tales marcadores tumorales se encuentran disponibles y se utilizan en forma rutinaria en el Instituto de Patología de la Universidad de Antioquia. En el caso de la medicina veterinaria, pueden ayudar al patólogo sobre todo en aquellos casos en los cuales el patrón histológico (con la coloración de rutina) no sea lo suficientemente claro en el diagnóstico de este tipo de neoplasias. La utilización de la técnica de inmunohistoquímica en el diagnóstico del tumor mixto mamario maligno en la ciudad de Medellín, inicia el camino hacia la utilización de otros marcadores tumorales, como los receptores de hormonas esteroides en tejido mamario canino, de tal modo que puedan establecer investigaciones tendentes a la terapia hormonal de este tipo de neoplasias en los caninos. De igual forma, el uso de anticuerpos monoclonales (citoqueratinas, vimentina y actina a músculo liso) en biopsias obtenidas por punción con aguja fina, facilita y agiliza el diagnóstico de los tumores mixtos mamarios y aporta al veterinario clínico la posibilidad de instaurar adecuadas técnicas quirúrgicas. Finalmente, los hallazgos de la presente investigación generan hipótesis para futuros proyectos tendientes a profundizar los conocimientos sobre la técnica de Inmunohistoquímica y su aplicación en el diagnóstico de otras neoplasias y permitien ampliar el trabajo diagnóstico en los Laboratorios de Patología Animal de referencia regional, al tiempo que amplía las posibilidades de investigación en este campo en Colombia.
Los autores agradecen la colaboración brindada por los Doctores Luis Carlos Cano y David Suescún Tarazona por la revisión del manuscrito y al Doctor Mario Robledo Villegas por su participación como asesor científico.
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